Le Western blot fournit une méthode semi-quantitative pour mesurer les taux de protéine. Cette méthode d'immuno-empreinte détecte la présence et la quantité relative de protéine, leur poids moléculaire et l'efficacité de l'extraction des protéines.
La technique de Western Blot est composée de 4 étapes :
- La séparation des protéines par électrophorèse sur gel
- Le transfert des protéines sur un support solide
- La détection de la protéine cible
- La visualisation de la protéine cible
Après l'étape de transfert, la membrane subit une étape de blocage qui recouvre toute la surface de la membrane avec une solution de détergent pour empêcher la liaison non spécifique de l'anticorps à la membrane. Ensuite, la membrane est incubée avec un anticorps primaire qui se lie à la protéine cible sur le transfert, suivi d'un anticorps secondaire conjugué qui se lie à l'anticorps primaire. Enfin, la protéine est visualisée par l'addition d'un réactif qui réagit à la présence du marqueur sur l'anticorps secondaire.
1- Matériel :
- Matériel SDS-PAGE
- Tampon de transfert : 0.04% SDS, 20% Methanol, 48 mM Tris, 39 M glycine
- Membrane de nitrocellulose
- 6 feuilles de papier filtre absorbant
- Dispositif de transfert
- Tampon de lavage : PBS avec 0.1% Tween ®20
- Solution de blocage : 3-5% BSA dans du PBS avec une petite quantité de Tween®20
- Plateforme agitateur orbital
- Anticorps primaires et anticorps secondaires conjugués appropriés
- Réactifs pour la visualisation du conjugué
2- Gel électrophorèse : Exécuter un SDS-PAGE pour séparer les protéines sur un gel
3- Transfert des protéines sur support solide :
1. Porter des gants lors de la manipulation de la membrane.
2. Couper une feuille de papier de nitrocellulose et 6 feuilles de papiers filtre absorbant à la taille exacte du gel SDS-PAGE.
3. Pré-humidifier la membrane de nitrocellulose dans de l'eau déminéralisée.
4. Faire tremper le gel, la membrane de nitrocellulose et les papiers absorbants dans un tampon de transfert pendant 5 minutes.
5. Appliquer la membrane à la surface du gel. Retirer les bulles d'air en faisant rouler une pipette à travers la membrane. Mettre en Sandwich le gel, la membrane blotting et des papiers absorbants buvards comme suit : plaque de fond (cathode) - 3 feuilles de papier absorbant - gel - membrane - 3 feuilles de papier absorbant - plaque supérieure (anode). Vérifier l'orientation du gel et de la membrane pour s'assurer que les protéines migrent dans la bonne direction; la membrane doit être au-dessus du gel faisant face à l'électrode positive.
6. Connecter les électrodes. Exécuter le transfert pendant 45 minutes à 1,5 heures avec un courant de 0,8 mA / cm2.
7. Couper l'alimentation. Enlever et démonter le sandwich, retirer la membrane de nitrocellulose.
8. Un coin peut être coupé afin de conserver l'orientation de la membrane.
Astuce : Si vous rencontrez des difficultés pour transférer les protéines sur les membranes de nitrocellulose, testez notre FLASHBLOT!!
4- Détection de la protéine cible :
1. Laver la membrane deux fois pendant 5 minutes avec de l'eau déminéralisée pour éliminer les composants du tampon de transfert et les protéines faiblement liées.
2. Incuber la membrane dans une solution de blocage pendant 30 minutes à 2 heures à température ambiante avec une agitation douce
3. Rincer la membrane avec du PBS pendant 5 minutes ; réaliser cette étape deux fois.
4. Diluer l'anticorps primaire dans une solution de blocage à une concentration comprise entre 1 pg/ml et 50 pg/ml. (Ex. Ajouter 10 µl d'un anticorps (à 1 mg/ml) à 10 ml d'une solution de blocage pour obtenir 1 pg/ml).
5. Incuber pendant au moins 1 heure à température ambiante ou une nuit à 4 °C avec une agitation douce.
6. Laver la membrane durant 5 minutes avec du PBS. Répéter ce lavage 3 fois.
7. Préparer la dilution de l’anticorps secondaire dans la solution de blocage. La concentration doit être comprise entre 0,5 et 5 pg/ml (une dilution de 1/200 -1/2000 d'un 1 mg/ml du stock).
8. Incuber la membrane dans la solution d'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante.
9. Laver la membrane durant 5 minutes avec du PBS. Répéter ce lavage 3 fois.
10. Égoutter le réactif et épongez la membrane sur un morceau propre de serviette en papier.
5- Visualisation de la protéine cible :
Préparer du réactif frais pour la visualisation et développer le blot.
Par exemple, avec un anticorps secondaire marqué à la phosphatase alcaline :
1. Ajouter 66 µl de NBT stock à 10 ml de tampon phosphatase alcaline avec le mélange
2. Ajouter 33 µl de BCIP stock
3. Ajouter 10 ml de solution par membrane de 15X15 cm2
4. Développer le transfert à température ambiante jusqu'à ce que les bandes s’assombrissent (env. 30 minutes)
5. Arrêter la réaction avec du PBS contenant EDTA 20 mM
Références :
Using Antibodies : A Laboratory Manual. Harlow & Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1999.
Introduction to Antibodies, 2nd Edition. Chemicon International.