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L’immunohistochimie (IHC) : Son origine, son principe, sa méthode et ses avantages

Qu’est-ce que l’immunohistochimie (IHC) ?

L’immunohistochimie trouve son origine en 1942 avec la publication de Coons et al. décrivant pour la première fois une coloration des antigènes du streptocoque bactérien sur du tissu infecté à l’aide d’anticorps conjugué FITC. C’est en 1966 que Nakane a introduit l’utilisation d’enzymes comme systèmes de révélation pour l’immunohistochimie (IHC) en microscopie optique. Le terme immunohistochimie a été défini à partir des mots « immunologie » en référence à l’utilisation d’un anticorps et « histologie » qui évoque l’utilisation de tissus.

 

L’immunohistochimie est une technique très répandue, car peu coûteuse et facilement réalisable. Elle permet de démontrer la présence ou l’absence d’une protéine dans les cellules d’une coupe de tissu inclus en paraffine (FFPE) ainsi que sa localisation. Son principe consiste à identifier une protéine d’intérêt grâce à un anticorps primaire spécifique, qui est lui-même reconnu par un anticorps secondaire directement couplé à une enzyme ou lié à un polymère couplé à une enzyme. Cette enzyme peut être la peroxydase de raifort aussi appelée HRP (Horse Radish Peroxidase) ou la phosphatase alcaline, aussi connue sous le nom de AP (Alkaline Phosphatase). Le complexe antigène-anticorps-enzyme est révélé grâce à un substrat spécifique de l’enzyme HRP ou AP. Il existe plusieurs chromogènes de l’HRP (DAB, Emerald, AEC, Permanent HRP green …) et de l’AP (BCIP/NBT, Permanent Red, Fast Red …). Une contre-coloration peut être réalisée en fin de marquage pour permettre une meilleure visualisation des tissus/cellules.

Avantages et inconvénients de l'immunohistochimie

Avantages

Inconvénients

Peu coûteux

Quantification des résultats difficile

Facilement réalisable

Lecture des lames non standardisée

Accès à de nombreux échantillons FFPE

Sujet à l'erreur humaine

Maintien de la structure cellulaire

Réalisable en manuel ou en automatique

Méthode : comment réaliser un protocole d'immunohistochimie

Diagomics vous propose un protocole détaillé que vous pouvez télécharger ici.

Voici en détails la méthode d’immunohistochimie (IHC) :


Étape 1 : Préparation des échantillons

  • Fixation du tissu prélevé 

  • Déshydratation du tissu

  • Inclusion en paraffine

  • Coupe du tissu au microtome

  • Séchage des lames


Étape 2 : Marquage

  • Déparrafinage

  • Réhydratation

  • Démasquage des épitopes

  • Blocage des sites non spécifiques (et des biotines endogènes si besoin)

  • Anticorps primaires 



Étape 3 : Révélation

  • Anticorps secondaire HRP ou AP / Polymère HRP ou AP

  • Chromogène (DAB, AEC, Permanent Red …)

  • Contre-coloration Hématoxyline



Étape 4 : Montage des lames

- Déshydratation

- Xylène

- Montage

Détection : Méthodes de révélation en IHC

Il existe principalement deux méthodes de révélation en IHC :

- dite ABC (ou LSAB), qui utilise un complexe Avidine (ou Streptavidine) / Biotine

- basée sur l’utilisation de polymères


Les systèmes ABC ou LSAB


C’est une méthode couramment utilisée pour la détection de protéines sur une coupe de tissu FFPE.

Elle est basée sur l'affinité élevée de l'avidine (ABC) ou de la streptavidine (LSAB) pour la biotine. Il faut noter que l'avidine peut donner du bruit de fond à cause de sa forte liaison électrostatique due à sa charge moléculaire ainsi qu’à cause de la présence de groupements glycosylés. La streptavidine ne présente pas ces problèmes, réduisant ainsi le bruit de fond. La biotine est présente naturellement dans de nombreux tissus. Ces biotines endogènes peuvent donner un marquage non spécifique en fixant l’avidine ou la streptavidine. Il faut donc absolument penser à les bloquer avant de réaliser la technique d’IHC.

*Schéma de Ventéo L 2011 Rev. Fr. Histotechnol 24

Les systèmes avec polymères


C’est une méthode qui utilise un polymère ou un micro-polymère. Les polymères sont composés d’un squelette de dextran sur lequel des anticorps secondaires et des enzymes (HRP ou AP) sont fixés. Les micro-polymères sont composés de plus petites molécules capables de polymériser et de se lier à des enzymes (HRP ou AP) et des anticorps secondaires. L’utilisation de micro-polymères facilite la pénétration dans les tissus et donc la détection d’antigènes difficiles d’accès comme les protéines nucléaires par exemple.

Cette méthode permet d'amplifier considérablement le signal, et donc d’augmenter la sensibilité, de réduire les liaisons non spécifiques et de diminuer le bruit de fond. Cette méthode offre la possibilité de détecter plusieurs antigènes différents sur une même coupe de tissu FFPE.

(Si vous voulez une comparaison des kits de détection, cliquez ici)

*Schéma pris de Ventéo L 2011 Rev. Fr. Histotechnol 24

Comparaison rapide des différents systèmes d’amplification

 ABC/LSAB

+

Amplification

Prix

-

Bruit de fond possible

Polymères

+

Amplification

Rapidité

Pas de bruit de fond

-

Prix

Optimisation

La technique d’immunohistochimie possède plusieurs étapes (voir protocole).

Si vous avez des marquages problématiques, vous trouverez ci-dessous des axes d’amélioration possibles.


1/ Démasquage 


Par la chaleur (aussi appelé HIER ou Heat-Induced Epitope Retrieval)

 

Il existe 3 tampons principaux de démasquage :

-       Tampon citrate à 10 mM pH 6,0

-       Tampon EDTA à 1 mM pH 8,0

-       Tampon Tris-EDTA pH 9,0

Le temps de démasquage est à déterminer selon le pH et l’antigène, mais aussi selon la méthode choisie :

-       Autocuiseur 15 à 30 min à 120°C

-       Bain-marie 20 à 60 min à 95°C - 98°C

L’utilisation d’un micro-onde n’est pas recommandée à cause du manque de reproductibilité.

 

Enzymatique (aussi appelé PIER ou Protease-Induced Epitope Retrieval)

 

Il existe plusieurs enzymes :

-       La pepsine

-       La pronase

-       La trypsine

-       La protéinase K

-       La ficine

Le temps d’incubation est de 10 à 20 min à 37°C en fonction de l’antigène et du tissu.

 

2/ La dilution de l’anticorps primaire 


La dilution de l’anticorps primaire est à définir selon sa concentration afin d’obtenir une concentration finale d’environ 1 µg/ml.

L’incubation de l’anticorps primaire peut se faire à température ambiante pendant 1h ou sur la nuit à 4°C.

Le choix du diluent est important, certains sont plus bloquants que d’autres.


3/ Les tampons de lavage 


Les étapes de lavage permettent de limiter le bruit de fond en enlevant tous les résidus perturbateurs. Les lavages se font généralement en tampon PBS avec 0,2% de tween ; si vous avez un peu de bruit de fond n’hésitez pas à augmenter le pourcentage de tween ou à passer en tampon TBS.

 

 

4/ Les tampons de blocage

 

Il existe plusieurs façons de bloquer les sites non spécifiques afin de diminuer le bruit de fond :

-       Tampon à base de BSA

-       SmartBlockTM à base de petits peptides synthétiques

-       The Blocking SolutionTM à base de caséine

-       Sérum normal d’animaux (chèvre, cheval, lapin …)

Le SmartBlock semble mieux pénétrer dans les tissus et ainsi permettre le blocage de plus de sites non spécifiques. Ceci dit, il est conseillé d’optimiser cette étape de blocage pour chaque anticorps et chaque tissu.

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